新的遗传工具揭示了衰老细胞在肝脏疾病中的双重作用-巨噬细胞驱动纤维化，而内皮细胞修复损伤，解锁靶向治疗的潜力。
在最近发表在《细胞》杂志上的一项研究中，研究人员探索了p16Ink4a+衰老细胞在不同细胞类型中在衰老、再生和疾病中的不同功能作用，使用新的遗传工具在体内追踪、消融和操纵这些细胞。
细胞衰老在衰老、癌症和疾病等过程中至关重要。由应激诱导，它涉及细胞周期阻滞、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂和衰老相关分泌表型(SASP)。衰老细胞既有促进衰老和疾病等有害作用，也有抑制肿瘤和修复组织等有益作用。需要进一步的研究来阐明它们的细胞类型特异性作用，并开发平衡其积极和消极影响的治疗方法。
基因组聚合酶链反应(PCR)是用裂解缓冲液和蛋白酶K在55°C下裂解小鼠尾巴或组织6小时以上。然后将混合物离心收集上清，用异丙醇沉淀上清以获得基因组DNA。用70%的乙醇洗涤DNA并溶解在去离子水中。小鼠使用特定于敲入序列的引物进行基因分型。
小鼠胚胎成纤维细胞实验，将胚胎第13.5天(E13.5)胚胎胰酶化，并通过细胞滤器收集细胞。细胞在含有10%胎牛血清和抗生素的Dulbecco's Modified Eagle培养基(DMEM)中培养，每2-3天更换一次培养基。四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化模型包括腹腔注射CCl4以增加剂量，然后收集肝脏进行分析。为了避免性别差异，本模型只使用雌性小鼠。
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)采用缺乏胆碱的l -氨基酸饮食诱导12周，仅使用雄性小鼠来防止性别相关变异。对于小干扰核糖核酸(siRNA)转染，使用Lipofectamine RNA interference MAX (RNAiMAX)试剂转染siRNA，然后在含FBS的完整培养基中孵育，然后收获用于分析。
(A) p16-tdT小鼠的敲入策略示意图。(B)实验策略示意图。(C) p16-tdT小鼠胚胎成纤维细胞(mef)对tdT和p16的免疫染色。(D)在指示器官中表达tdT的细胞百分比的定量。数据代表平均值±SD;每组N=5。(E)高龄p16-tdT小鼠(104-108周龄)组织切片上tdT及指定抗体的免疫染色。箭头表示tdT+谱系+细胞。(F)基于免疫染色数据的老年小鼠p16Ink4a+细胞不同细胞类型示意图。标尺，100 μm。每张图像代表4-5个单独的样本。
p16Ink4a+由cdk2a (Cdkn2a)编码，是一种被广泛认可的细胞衰老标志物，在衰老和疾病等过程中至关重要。开发了一种基于荧光的报告细胞系p16-tdTomato (tdT)，以研究其在不同细胞类型中的表达，从而实现了p16Ink4a+表达的单细胞分辨率。通过小鼠胚胎成纤维细胞(mef)验证，p16Ink4a+细胞随着年龄的增长呈现衰老表型，其特征是衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色增加，Ki67表达降低。此外，p16-tdT细胞表达了高水平的其他衰老标志物，如p21和白细胞介素(IL)-6，增强了该模型研究p16Ink4a+表达的可靠性。
衰老p16-tdT小鼠各器官的荧光成像显示，随着年龄的增长，tdT+细胞增加，特别是在大脑皮层神经元和胰腺内分泌细胞中。这些tdT+细胞表现出强烈的衰老相关表型，如SASP因子升高和增殖能力降低，证实了衰老组织中衰老细胞群的多样性。
为了研究衰老细胞在肝纤维化中的作用，我们用CCl4处理p16-tdT小鼠，诱导纤维化。在纤维化区域，特别是巨噬细胞和内皮细胞(ECs)中观察到tdT+衰老细胞的富集，但在肝细胞中没有。流式细胞术和免疫染色进一步证实了这些细胞类型的亚群表达p16Ink4a+并表现出衰老特征。单细胞RNA测序(scRNA-seq)证实了这些发现，显示p16ink4a +巨噬细胞和内皮细胞中衰老标志物和SASP因子上调。
为了追踪p16Ink4a+细胞在肝损伤和修复过程中的命运，我们开发了Sn-pTracer系统，可以对衰老巨噬细胞和内皮细胞进行特异性标记。结果显示，在损伤期间被标记的p16Ink4a+巨噬细胞在修复过程中被耗尽，而内皮细胞持续存在，并随着时间的推移表现出衰老标记物的减少。
此外，我们还开发了一种新的基因工具Sn-cTracer，用于消融p16Ink4a+细胞。肝纤维化中消融p16Ink4a+巨噬细胞可显著减轻纤维化，而消除p16Ink4a+ ECs则加重肝损伤。这一差异结果表明，衰老的巨噬细胞促进纤维化，而衰老的内皮细胞起修复作用。
最后，在肝损伤模型中通过Kdr过表达重编程p16Ink4a+ ECs可显著减少纤维化，突出了以细胞类型特异性方式靶向衰老细胞群以改善组织修复和限制纤维化的治疗潜力。
该研究引入了两种强大的遗传工具，Sn-pTracer和Sn-cTracer，旨在追踪和操纵特定细胞类型的p16Ink4a+衰老细胞。Sn-pTracer允许精确的谱系追踪，而Sn-cTracer允许细胞类型特异性消融，克服了早期模型缺乏特异性的局限性。
综上所述，以往使用p16Ink4a+细胞系统清除的研究缺乏细胞类型特异性，忽略了组织间细胞身份的差异。为了解决这个问题，研究人员开发了四种遗传策略来研究特定的p16Ink4a+细胞类型。在肝纤维化中，衰老的巨噬细胞促进纤维化，而衰老的内皮细胞有助于组织修复。消融p16Ink4a+巨噬细胞可减少纤维化，而消除p16Ink4a+ ECs则会损害修复。Kdr过表达的ECs重编程增强了它们的功能，减少了纤维化，为未来抗衰老疗法的发展提供了重要的见解。
